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紅豆杉的組織培養
紅豆杉屬于裸子植物，主要分布于我國的云南、四川、西藏和東北，是一類具有重要開發價值的樹木，它產生的紫杉醇通過臨床實驗被認為是最有希望的抗癌藥物。自然狀態下，紫杉醇的含量極低，僅占樹皮干重的十萬分之一，靠自然資源解決這一問題十分困難。同時由于自然狀態下紅豆杉生長速度很慢，過量的人工采伐，使野生資源受到了極大的破壞，在一些產地已面臨滅頂之災，保護其野生資源和擴大藥源已成為當前急需解決的矛盾。用播種育苗和扦插繁殖雖可在一定程度上緩解矛盾，但仍無法滿足需求，也不能從根本上解決問題。利用植物組織培養和細胞培養的方法來解決資源和藥源的矛盾，已成為國內外學者關注的問題。 （一）材料 較為適宜的組培外植體為新生的嫩枝，取材時間以每年的7、8月份為宜。 （二）培養程序 1、愈傷組織誘導用培養基 培養基的基本成分采用B5或MS的微量元素、有機物和鐵鹽，外加KNO3 2500mg/L,NH4NO3 825mg/L KH2PO4 、240mg/L,MgSO4·7H2O 370mg/L,CaCl2·2H2O660mg/L。添加的激素種類及數量為NAA 0.8-1.0mg/L、 BA0.3-0.5mg/L，調PH值為5.8-6.0；瓊脂粉和蔗糖用量分別為5.6-6.0g/L和30g/L。配置好的培養基用培養瓶分裝，經高溫、高壓滅菌后備用。 2、材料消毒與接種 取新生的嫩枝（帶有針葉）放入加有0.02%洗潔精的自來水中浸泡10分鐘，浸泡過程中需經常攪動，浸泡結束后用自來水沖洗10分鐘以上。將嫩枝轉入一干凈的三角瓶中。 以下所有操作必須在超凈工作臺上進行無菌操作。首先往三角瓶中加入75%的酒精，加入量應為嫩枝體積的10倍以上，浸泡殺菌30-60秒，倒掉酒精，用無菌蒸餾水年漂洗一次；再將嫩枝轉入事先已高壓消毒的三角瓶中，加入15倍與嫩枝體積的0.1%的升汞溶液，浸泡殺菌5-8分鐘，浸泡過程中要不斷搖動，以使升汞與嫩枝充分接觸。為了達到徹底殺菌的效果，有人建議在升汞溶液中加入0.02%的表面活性劑，這樣可能更好一些，但要相對縮短殺菌時間。倒掉升汞溶液，用無菌蒸餾水沖洗4-6次，每次1-2分鐘，以徹底除去升汞。將嫩枝從三角瓶中分批取出，用無菌濾紙吸去材料表面的水分，將嫩枝切成 0.5-0.8CM的小段，并切取部分針葉，嫩枝切段和針葉同時用作外植體，接種在誘導愈傷組織的培養基上。接種時要讓針葉的腹面接觸培養基，嫩枝的植物學近地端接觸培養基。 注意用過的升汞溶液和沖洗液不要到處亂倒，以防重金屬污染。 將接種好的培養物放置于培養室中培養，溫度（25±2）℃，光照強度1500-2000lx，光照時間10h/d。 3、愈傷組織誘導 紅豆杉嫩枝和針葉在培養基上2-3周后即開始形成愈傷組織，約4-5周愈傷組織直徑可達1-2CM。不同種的紅豆杉和不同的外植體之間形成愈傷組織的比率、時間早晚和生長速度存在明顯差異，南方紅豆杉和東北紅豆杉的嫩枝切段出愈較快，出愈率分別為89%和70%，針葉出愈較慢，出愈率也較低，分別為 36%和15%；普通紅豆杉出愈較慢但出愈率較高，嫩枝和針葉的出愈率分別為94%和30%。愈傷組織開始時為灰白色，隨著愈傷組織的增大，先期形成的愈傷組織顏色由灰白色變為棕色，這可能預示著愈傷組織在逐漸發生褐變，因此要及時給予注意，盡量保持較低的培養溫度和經常更換培養基。當愈傷組織生長到一定大小時即可轉入液體進行懸浮培養。 4、細胞懸浮培養與繼代 利用愈傷組織而不是用小苗或大樹來生產提取紫杉醇，是一條正在探索的途徑，如果成功則可以實現工廠化生產，從根本上解決紅豆杉資源不足的矛盾。 因此，通過嫩枝和針葉培養產生的愈傷組織不需要進行芽分化的誘導，而是將愈傷組織直接轉入細胞懸浮培養。具體做法是將從嫩枝和針葉上產生的愈傷組織取下來直接轉入液體培養基中進行（懸浮）振蕩培養，所用培養基與上述誘導培養基相同。在初次將愈傷轉到液體培養基即可適當加入少量纖維素酶和果膠酶，以加快愈傷組織分離成單個細胞或小細胞團。 在初次懸浮培養階段可用50ml的小三角瓶，每瓶加10ml液體培養基，放入愈傷組織，在20-23℃的搖床上振蕩培養，光照條件與普通培養相同。每周需要更換一次培養基，更換時用5-10ml的平頭移液管將三角瓶中的愈傷組織、單個細胞或細胞團過濾出來，直接轉到新鮮的培養基中即可。 在懸浮培養過程中應隨時注意每一瓶中愈傷組織、細胞團生長的情況，挑選生長速度最快和特征最好的作為繼代的材料，毫不可惜的丟掉那些不好的（生長緩慢、顏色不正等）材料，這樣經過幾代的選擇，就可以挑出符合理想的材料，作為懸浮系進行擴增培養。 （三）紫杉醇含量的檢測 現行的比較普遍有效的方法是利用薄層層析法，其大體過程是先將愈傷組織干燥，再用甲醇滲濾提取，獲得提取液，經減壓濃縮至干，用水：CHCl3取。合并 CHCl3部分，再經減壓濃縮獲得粗提液，經薄層層析，收取喊紫杉醇和10-脫乙酰基巴卡丁-III的部分，再進行硅膠柱層析，分離收集相應流分，減壓濃縮，TLC再次檢測，將含有紫杉醇的濃縮液進行二次柱層析，鑒定結果。另外，紅豆杉愈傷組織經過一定分離提取后，可進行高效液相色譜層析（HPLC）分析，分析柱為4mm*250mm的C18柱，dp=10μm，分離體系為甲醇-乙腈-水（20：33：47）等速洗脫，流速為1ml/min。 關于紅豆杉植物組織細胞培養中褐化的問題是當前存在的一個重要問題，該現象與普通木本植物組培中出現的褐變不同。普通木本植物出現的褐變可通過選用較小的外植體、培養基中加活性炭、縮短繼代轉移周期、盡量少損傷外植體等措施加以克服，且以后不再發生。但是，利用上述方法解決紅豆杉的褐化問題收效甚微，這或許是因為紫杉醇本身對細胞生長具有毒害作用，其量的積累往往對細胞的增殖起抑制作用。如何解決提高細胞內紫杉醇的含量而又不給細胞的生長帶來很大影響，使二者相協調一致，是急需研究的課題。
編輯：Aggie |
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