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組織培養技術
植物組織培養即植物無菌培養技術，是根據植物細胞具有全能性的理論，利用植物體離體的器官、組織或細胞，如根、莖、葉、花、果實、種子、胚、胚珠、子房、花藥、花粉以及貯藏器官的薄壁組織、維管束組織等，在無菌和適宜的人工培養基及光照、溫度等條件下，能誘導出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。至今，世界各國在無性系繁殖、花卉育種、植株脫病毒和種質保存等方面，廣泛應用組織培養技術。 （一）組織培養技求的應用 1．無性系繁殖無性系繁殖是植物組織培養應用的主流之一，用植物組織培養進行無性繁殖的優點是，用材少，速度快，不受氣候、季節、基質等自然條件的影響，比傳統的常規繁殖方法要快得多，人們又叫它"快速繁殖"或"微型繁殖"。其常見繁殖方式有短枝扦插、芽增殖、原球莖、器官分化和胚狀體發生。其中芽增殖在盆栽花卉繁殖中應用最為普遍，如草本植物四季秋海棠、雞冠花、萬壽菊、長春花，觀葉植物蟆葉秋海棠、網紋草、花葉芋、天鵝絨竹芋，木本植物三角花、比利時杜鵑、月季、八仙花等，在生產實踐中，均已取得較好的經濟效益。原球莖培養在大花蕙蘭、蝴蝶蘭、美麗兜蘭、石斛、春蘭等蘭科植物和腎蕨、鳳尾蕨、鹿角蕨等觀賞蕨的規模性生產中得到廣泛應用。胚狀體培養，據報道目前已在30個科150種植物上觀察到它們的愈傷組織可以分化出胚狀體，而盆栽花卉中的花葉芋、山茶花都是成功的范例。器官分化主要是從外植體直接產生不定芽或不定根，一般不通過從愈傷組織進行器官分化形成植株，因為其性狀有可能發生變化或經過多次繼代培養后，會喪失再生植株的能力。 2．花卉育種當今盆栽花卉育種中，也廣泛應用組培技術。 胚培養：在花卉種間雜交或遠緣雜交中，有時雖然能正常受精，但胚往往發育不完全或胚與胚乳間不親和，不能得到種子，可采用胚的早期離體培養促使胚正常發育，培養出雜交后代。如山茶花、百合和鳶尾雜交中均采用幼胚培養，成功地收到了雜交種子。同時，在雜交中受精困難，也可把未受精的胚珠分離出來，在試管內用花粉受精來解決，這在草本花卉花菱草中已取得成功。 單倍體育種：利用花藥培養誘導花粉形成單倍體，在試管培養中通過秋水仙素處理，使染色體加倍，而成為純合二倍體植物，從而縮短新品種育種的時間，還有利于突變中隱性突變的分離。這在花卉的株型、花色、花型的大小或重瓣，葉型、葉色等產生變異，往往有直接利用價值。這在矮牽牛的育種中已應用。 體細胞雜交和植物基因工程：利用原生質體遺傳操作技術，可以從原來不大可能進行雜交的不同屬植物間獲得體細胞雜種或核質雜種。可以通過攝取外源目的基因，定向改造植物的某些重要性狀。 3．植株脫病毒用無性繁殖方法來繁衍的花卉種類如菊花、香石竹、郁金香、百合、白鶴芋等，不能通過種子途徑去除病毒，用化學方法防治和高溫處理往往成效不穩定。作為組織培養的無性繁殖材料，最好是去病毒組織，否則易導致病毒積累，危害加重。而植物的莖尖部分無維管束，病毒難以侵入。所以，莖尖培養是獲得無病毒植株的最好途徑。至今，莖尖培養脫毒法已在菊花、百合、香石竹、郁金香等盆栽花卉上推廣使用。 4．種質保存用無性繁殖的植物，因沒有種子，只能在植物園內長期栽培保存，耗費大量的土地和勞力。種質材料還易受自然環境的變化和病蟲危害而流失。若用組織培養方法，保存愈傷組織、胚狀體、莖尖等組織，可節省大量人力和物力。 （二）組織培養的幾個步驟 1．材料的選用一般用于組織培養的材料稱為外植體。常分為兩類。一類是帶芽的外植體，如莖尖、側芽、鱗芽、原球莖等，組織培養過程中可直接誘導叢生芽的產生。其獲得再生植株的成功率較高，變異性也較小，易保持材料的優良性狀。另一類主要是根、莖、葉等營養器官和花藥、花瓣、花軸、花萼、胚珠、果實等生殖器官。這一類外植體需要一個脫分化過程，經過愈傷組織階段，再分化出芽或產生胚狀體，然后形成再生植株。 外植體的取用與組織部位、植株年齡、取材季節以及植株的生理狀態、質量，都對培養時器官的分化有一定影響。一般階段發育年幼的實生苗比發育年齡老的栽培品種容易分化，頂芽比腋芽容易分化，萌動的芽比休眠芽容易分化。在組織培養中，最常用的外植體是莖尖，通常切塊在0．5厘米左右，太小產生愈傷組織的能力差，太大則在培養瓶中占據空間太多。培養脫毒種苗，常用莖尖分生組織部，長度為0．1毫米以下。 2．外植體的消毒植物組培能否取得成功的重要因素之一，就是保證培養物在無菌條件下安全生長。為此，必須抓好外植體的消毒和實行無菌操作。 由于培養的植物材料大都采集于田間栽培植株，材料上常附有各種微生物，一旦被帶入培養基，即會迅速繁殖滋長，造成污染，培養失敗。所以培養前必須對外植體進行嚴格的消毒處理，消毒的尺度為既能全都殺滅外植體上附帶的微生物，但又不傷害材料的生活力。因此，必須正確選擇消毒劑和使用的濃度、處理時間及程序。目前，常用的消毒劑有次氯酸鈣、氯化汞、次氯酸鈉、雙氧水、酒精（70％）等。具體消毒方法如下： （1）莖尖、莖、葉片的消毒消毒前先用清水漂洗干凈或用軟毛刷將塵埃刷除，茸毛較多的用皂液洗滌，然后再用清水洗去皂液，洗后用吸水紙吸干表面水分，用70％酒精浸數秒鐘，取出后及時用10％次氯酸鈣飽和上清液浸泡10～20分鐘。或用2％～10％次氯酸鈉溶液浸泡6～15分鐘。消毒后用無菌水沖洗3次，用無菌紗布或無菌紙吸干接種。 （2）根、塊莖、鱗莖的消毒這類材料大都生長在土中，常帶有泥土，挖取時易遭損傷。消毒前必須先用凈水清洗干凈，在凹凸不平處以及鱗片縫隙處，均用毛筆或軟刷將污物清除干凈，用吸水紙吸干后，在70％酒精中浸一下，然后用6％～10％次氯酸鈉溶液浸5～15分鐘，或用0．1％～0．2％氯化汞消毒5～10分鐘，最后用無菌水清洗3～4次，用無菌紗布或無菌紙吸干后接種。 （3）果實、種子的消毒這類材料有的表皮上具有茸毛或蠟質，消毒前先用70％酒精浸泡幾秒鐘或2～10分鐘，然后用飽和漂白粉上清液消毒10～30分鐘或2％次氯酸鈉溶液浸10～20分鐘，消毒后去除果皮，取出內部組織或種子接種。直接用種子或果實消毒，經消毒后的材料均須用無菌水多次沖洗后接種。 （4）花藥、花粉的消毒植物的花藥外面常被花瓣、花萼包裹著，一般處于無菌狀態，只需采用表面消毒即可接種。通常先用70％酒精棉球擦拭花蕾或葉鞘，然后將花蕾剝出，在飽和漂白粉上清液中浸泡10～15分鐘，用無菌水沖洗2～3次，吸干后即可接種。 3．組織培養的條件接種后的培養容器置放培養室，室溫應控制在23～26℃，每天12～16小時光照，光照度為1000～3000勒克斯。 4．外植體的增殖接種后的外植體要分化出叢狀芽、愈傷組織或胚狀體，必須對培養基及激素的種類和濃度進行嚴格的設計和篩選。常用的基本培養基為MS培養基，激素的種類和濃度對外植體的分化和增殖起到重要的作用。也就是說不同的花卉種類對激素的種類和濃度是有差別的（表4－－3）。
5．誘導生根繼代培養形成的不定芽和側芽等一般沒有根，要促使試管苗生根，必須轉移到生根培養基上，生根培養基一般應用1／2MS培養基，因為降低無機鹽濃度有利于根的分化。同時，不同盆栽花卉誘導生根時所需要的生長素的種類和濃度是不同的（表4－4）。一般常用吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）三種。一般在生根培養基中培養1個月左右即可獲得健壯根系。 6．組培苗的移栽生根或形成根原基的試管苗從無菌，溫、光、濕度穩定環境中進入到自然環境中，從異養過渡到自養過程，必須經過一個煉苗過程。首先打開試管瓶塞放陽光充足處讓其鍛煉1～2天，然后取出幼苗用溫水將瓊脂沖洗掉，移栽到泥炭、珍珠巖、蛭石、礱糠灰等組成的基質中，基質使用前需高溫消毒，移栽后要適當遮蔭，可用塑料薄膜覆蓋，保持較高空氣濕度，溫度維持在25℃左右，勿使陽光直曬，7～10天后要注意通風和補充澆水，約20～40天，新梢開始生長后，小苗可轉入正常管理。
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